PI9714887 PROCESSO PARA SELEÇÃO DE PLANTAS LEGUMINOSAS GENETICAMENTE TRANSFORMADAS
Depósito: 07/10/1997
Destaque: Prêmio da Fundação Peter Muranyi
Inventor: Elibio Leopoldo Rech Filho / Francisco Jose Lima Aragao
Titular: Embrapa-Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (BR/DF)
A invenção tem como objetivo superar as limitações dos métodos existentes, que apresentam baixa eficiência e alta formação de plantas quiméricas (mistura de células transgênicas e não transgênicas). O processo combina três etapas principais: primeiro, a introdução de genes exógenos nas células do meristema apical de eixos embrionários de leguminosas por biobalística (bombardeamento com microprojéteis); em seguida, a indução de multibrotação por meio do cultivo em meio com citocininas como BAP ou tidiazuron; e, por fim, a seleção das células transformadas utilizando um agente seletivo (como herbicida) que se concentra na região meristemática. A invenção permite uma frequência de regeneração de plantas transgênicas em torno de 10%, valor cerca de 200 vezes superior aos métodos convencionais (0,03–0,05%). O processo é aplicável a diversas leguminosas, como soja, feijão, caupi e amendoim, e possibilita a obtenção de plantas fértis com características agronômicas desejáveis em menor tempo e com menor ocorrência de variações genéticas indesejadas. A seleção é feita de forma eficiente graças ao uso de moléculas que atuam preferencialmente no meristema, eliminando células não transformadas sem prejudicar o desenvolvimento da planta. Exemplos detalhados ilustram a aplicação do método com diferentes herbicidas (Imazapyr e glifosato) em diversas espécies, confirmando a viabilidade e a alta taxa de sucesso do processo.
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) ocupa cerca de 12 milhões de hectares e é a leguminosa mais importante na alimentação de mais de 500 milhões de pessoas na América Latina e África. O Brasil é o maior produtor mundial, com produção anual de aproximadamente dois milhões de toneladas, representando cerca de 20% da produção global. O feijão é a principal fonte de proteína vegetal para a população brasileira, com consumo per capita de 14 kg/ano. Suas sementes possuem teor proteico entre 20% e 33% e valor energético de cerca de 340 cal/100g. A produção no país é majoritariamente realizada por pequenos produtores, com cerca de 80% da área cultivada em propriedades menores que 100 hectares. Com o avanço da tecnologia do DNA recombinante, tornou-se possível isolar, clonar e introduzir genes de diversas origens em plantas, rompendo barreiras entre espécies e reinos. A transformação genética permite a introdução de genes específicos em cultivares comerciais, complementando os programas de melhoramento genético. Décadas de pesquisa levaram ao desenvolvimento de métodos como a biobalística, a transformação por Agrobacterium e a eletroporação. No final dos anos 80, Sanford propôs a biobalística como método direto de introdução de material genético em plantas superiores, técnica que se mostrou versátil e eficiente. A biobalística utiliza microprojéteis de ouro ou tungstênio, acelerados a mais de 1.500 km/h, para introduzir ácidos nucleicos em células e tecidos. A onda de choque necessária pode ser gerada por explosão química, alta pressão de hélio ou descarga elétrica. As partículas penetram as células de forma não letal, permitindo a liberação e integração do DNA exógeno no genoma. Uma grande vantagem desse método é a possibilidade de transformar diretamente células do meristema apical, embora a regeneração de plantas férteis a partir dessas células ainda seja um desafio crucial.
Ao longo das últimas décadas, inúmeras tentativas foram realizadas para regenerar plantas férteis de leguminosas de importância comercial, mas os resultados efetivos permaneciam limitados. Os métodos existentes de transformação genética por biobalística – embora permitissem a introdução de DNA em células meristemáticas – apresentavam grandes desvantagens, como a impossibilidade de selecionar as células verdadeiramente transformadas e baixíssimas taxas de regeneração de plantas transgênicas. Foi nesse contexto que a invenção dos pesquisadores Elibio Rech e Francisco Aragão trouxe uma contribuição significativa. Eles desenvolveram um processo inovador que não apenas introduz genes exógenos via biobalística no meristema apical de eixos embrionários, mas também combina etapas cruciais de indução de multibrotação e seleção eficiente das células modificadas. A chave do método está no uso de um agente seletivo que se concentra especificamente na região meristemática, permitindo eliminar células não transformadas sem prejudicar o desenvolvimento da planta. Surpreendentemente, esse processo alcança uma frequência de regeneração de plantas transgênicas em torno de 1%, um avanço expressivo em comparação com os índices anteriores, que variavam de apenas 0,03% a 0,05%. Na prática, o meristema apical do feijoeiro é bombardeado com microprojéteis revestidos com o DNA de interesse. Em seguida, os eixos embrionários são cultivados em meio com citocininas para induzir múltiplas brotações a partir das células transformadas. Após essa etapa, a seleção é feita com herbicida ou outra molécula que atue no meristema, assegurando que apenas os brotos transgênicos se desenvolvam. Esses brotos são então enraizados, transferidos para o solo e capazes de produzir sementes transgênicas. A biobalística mostra-se vantajosa por permitir a transformação direta de tecidos organizados, como o meristema, sem necessidade de protoplastos ou cultivo de tecidos desdiferenciados. As partículas penetram nas células de modo não letal, e o DNA é liberado e integrado ao genoma, possibilitando a expressão do gene inserido. Dessa forma, a invenção supera uma das maiores limitações da transformação de leguminosas: a baixa eficiência na regeneração de plantas férteis geneticamente modificadas.
O mosaico-dourado, causado pelo vírus BGMV, é uma das doenças mais devastadoras do feijoeiro no Brasil e na América Latina, podendo causar perdas de 40% a 100% na lavoura. Transmitido pela mosca-branca, o controle químico é ineficaz, tornando urgente o desenvolvimento de variedades resistentes. A Embrapa iniciou em 1992 um projeto para obter feijoeiros transgênicos tolerantes ou imunes ao vírus, já que não existiam fontes naturais de imunidade. A primeira estratégia adotada foi a tecnologia anti-senso, na qual um gene viral modificado era inserido na planta para produzir um RNA complementar ao RNA do vírus, bloqueando sua multiplicação. Embora tenham sido obtidas plantas com sintomas mais brandos, os pesquisadores buscaram uma solução mais eficiente. A estratégia seguinte, denominada transdominância letal, mostrou-se bem-sucedida: um gene defeituoso da DNA-polimerase do vírus foi introduzido no feijão, fazendo com que a planta produzisse uma proteína "defeituosa" que se ligava ao DNA viral, impedindo sua replicação. Com essa técnica, foram obtidas três linhagens de plantas imunes, que não apresentavam sintomas nem presença detectável do vírus mesmo após três gerações. Essas linhagens estão sendo incorporadas ao programa de melhoramento genético convencional da Embrapa como doadoras do gene de resistência. Paralelamente, também foram desenvolvidas plantas transgênicas expressando a albumina 2S da castanha-do-pará, visando aumentar o teor de metionina nos grãos. Os resultados demonstram o potencial da engenharia genética para enfrentar desafios agronômicos e nutricionais na cultura do feijão.
O Ibama concedeu licença para que plantas de feijão transgênico resistentes ao vírus do mosaico dourado (BGMV) sejam testadas em campo na Embrapa Arroz e Feijão, em Goiânia (GO). Os pesquisadores Francisco Aragão e Josias Faria foram premiados pela Fundação Peter Muranyi devido ao projeto "Obtenção de feijoeiro resistente ao vírus do mosaico dourado", que se destacou na categoria alimentação. O prêmio reconhece contribuições científicas que beneficiam o bem-estar da população, especialmente no Brasil. O feijão é a leguminosa mais importante na alimentação de mais de 500 milhões de pessoas na América Latina e África, e o mosaico dourado, transmitido pela mosca-branca, é sua principal praga, podendo causar perdas de até 100% na produção. A doença é particularmente devastadora para os pequenos produtores, que respondem por cerca de 80% da cultura no Brasil. O feijão transgênico resistente foi desenvolvido por uma equipe liderada pelo professor Elibio Rech em uma época em que a Lei de Propriedade Industrial de 1971 impedia a patenteabilidade de produtos alimentícios. Por isso, inicialmente não foi depositada patente, o que permitiria que qualquer empresa utilizasse comercialmente a tecnologia sem compensar a Embrapa. Com a nova lei de 1996, que passou a permitir a proteção patentária para esse tipo de invenção, um pedido de patente foi depositado junto ao INPI em 1997.
Elibio Rech obteve o título de Bacharel (BSc.) em Engenharia Agronômica pela Universidade de Brasília, Brasília, Distrito Federal, em 1980, com o projeto final intitulado: Estudo sócio econômico da agropecuária dos Cerrados. Obteve o título de Mestre (MSc.) em Fitopatologia pela Universidade de Brasília, em 1983, com a dissertação: Efeito antagônico de Bacillus subtilis, Pseudomonas spp. e Trichoderma harzianum a fungos fitopatogênicos. Em 1989, obteve o título de Doutor (PhD.) em Life Sciences, pela University of Nottingham, Nottingham, na Inglaterra, com a dissertação: Electric fields and Agrobacteria for gene transfer into plants. Realizou Pós-doutorado em 1990 na University of Nottingham/Oxford na Inglaterra, sobre a manipulação de cromossomos artificiais de levedura (YAC?s), parte do projeto do genoma humano. O Dr. Elibio Rech criou e lidera um grupo de pesquisas, que atualmente constitui referencia nacional e internacional na expressão de proteínas heterólogas em vegetais e animais.
Resumo: PI9714887 A presente invenção refere-se a um processo para produção de plantas leguminosas transgênicas contendo DNA exógeno compreendendo as etapas de introdução de genes exógenos em células do meristema apical de eixos embrionários de plantas leguminosas através do método de biobalística, indução de multibrotação das células na região meristemátia apical modificada na etapa anterior através do cultivo de seus eixos embrionários em um meio contendo um indutor de multibrotação e seleção das células meristemáticas da região apical transformadas através do cultivo ulterior dos referidos eixos embrionários em um meio contendo um agente de seleção.
Referências:
Patentes: Onde o Brasil perde, Sindicato da indústria de Artefatos de papel, Papelão e Cortiça no Estado de São Paulo, dez/93, pg 7
acesso em abril de 2002
"Fundação Peter Murányi premia pesquisadores que desenvolveram feijão resistente ao mosaico dourado" Autor: Mauricio Cardoso Repórter da Agência Brasil Fonte:Agência Brasil 13/4/2004
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